В листьях и стеблях несчастных растений патогены из рода Xanthomonas ведут микроскопическую войну с помощью секретного оружия: эффекторов, подобных активаторам транскрипции (TALE). Микроорганизмы-захватчики выделяют эти белки, чтобы активировать гены в растительных клетках и способствовать выживанию микроорганизмов.

Впервые обнаруженные в 1989 году как отдельные белки, участвующие в вирулентности патогенов, TALE и реакция, которую некоторые растения развили в ответ на них, привлекли внимание генетиков растений. К середине 2000-х годов исследователи TALE знали, что эти белки обладают сигналом ядерной локализации, доменом активации транскрипции и доменом с несколькими, в основном повторяющимися блоками из 33–35 аминокислот, которые сегодня называются повторяющимися вариабельными диостатками (RVD), способствующими экспрессии генов.

Однако вопрос о том, как эти участки соотносятся с конкретными последовательностями ДНК, оставался нерешённым. Учёные, изучающие растения, подозревали, что понимание этого механизма может помочь в выявлении мишеней во время развития болезни и в разработке контрмер для защиты сельскохозяйственных культур. Когда исследователи выяснили, как TAL-белки выбирают свои мишени в ДНК, это вывело эти молекулярные машины на более широкую исследовательскую арену в качестве инструментов для редактирования генов, что в конечном итоге подготовило почву для революции в этой области.

Происхождение TALENs: Взлом кода

В 2007 году Йенс Бох, в то время научный сотрудник группы Уллы Бонас из Университета Мартина-Лютера в Галле-Виттенберге, вместе со своим коллегой устранял проблему: два разных белка TALE активировали один и тот же ген. “Именно тогда я, по сути, сказал:‘Почему бы не посмотреть на это так, как если бы один из этих RVD распознал одну базу", - вспоминал он.

Жюльен Вальтон возглавляет исследовательскую группу в Cellectis, которая использует технологию TALEN для улучшения методов генной терапии, в том числе клеточной терапии, такой как CAR-T-клетки.

Дуэт записал повторяющиеся последовательности одну под другой и заметил закономерность: в то время как большая часть последовательности из 34 аминокислот была одинаковой, 12-й и 13-й остатки различались в разных повторах. Почувствовав, что они, возможно, нашли решение проблемы специфичности TALE-последовательностей, группа экспериментально проверила свои выводы. Снова и снова они могли достоверно предсказать, к каким последовательностям будет связываться конкретный TALE, просто взглянув на эти две аминокислоты в RVD.

«Я не мог уснуть две ночи», — сказал Бох, сегодня работающий генетиком растений в Ганноверском университете имени Лейбница, вспоминая своё волнение. «Сразу стало ясно, что белок можно перепрограммировать, чтобы он направлялся в любую конкретную точку генома».

Примерно в то же время генетик растений Адам Богданов, работавший в то время в Университете штата Айова, и его аспирант Мэтью Моску пришли к такому же выводу, используя вычислительные методы. Посетив группу Боха ранее в этом году, Богданова написала им об их находках. Две группы опубликовали свои соответствующие результаты в Science в октябре 2009 года. Код СКАЗКИ был взломан. “Это было захватывающее время”, - сказал Бох.

"TAL-эффекторы произвели революцию в области таргетинга на ДНК, а CRISPR демократизировал её." —Адам Богданов, Корнельский университет.

Вскоре после этой публикации Богданов начал сотрудничать с Дэниелом Войтасом, генетиком растений из Университета Миннесоты. Войтас интересовался разработкой инструментов для редактирования генома растений. В 2009 году ведущей технологией для этого были цинковые пальцы, но их было сложно сконструировать.

Войтс и Богданов объединили FokI, эндонуклеазу, используемую в доменах цинковых пальцев, с TALE, чтобы создать нуклеазы TALE (TALEN). «Это стало тем, чем все заинтересовались», — сказал Богданов, который сегодня работает в Корнеллском университете. «Все, кто исторически интересовался редактированием генома, начали изучать TALEN и разрабатывать их». Последующие группы усовершенствовали эти новые нуклеазы, удалив ненужные элементы из белка и выявив домены, которые упрощают распознавание оснований.

«Всё сообщество специалистов по редактированию генома было в полном восторге, потому что было очень сложно заставить нуклеазы с цинковыми пальцами работать целенаправленно», — объяснил Бох. В отличие от них, с расшифрованным кодом TALE, TALENs были более простыми.

TALENs также стали более популярными, чем цинковые пальцы или другой инструмент для редактирования генов — мегануклеазы, по менее технической причине: Войтс и Богданов сделали свой метод и реагенты доступными на сайте Addgene, где можно обмениваться ресурсами. «Этот набор, который Дэн Войтс создал и поделился им со всем миром, на самом деле сыграл решающую роль в том, чтобы люди начали использовать эти технологии», — сказал Чарльз Герсбах, инженер-биомедик из Университета Дьюка. Кроме того, несколько веб-сайтов, в том числе разработанный компанией Bogdanove, помогли исследователям создать собственные TALEN для своих приложений.

В то время Герсбах недавно основал свою группу в Университете Дьюка, изучавшую цинковые пальцевые нуклеазы. Он вспомнил, что думал, что новые TALENs звучат интересно, но он скептически относился к тому, что они сработают. Когда один из его студентов попросил поработать над TALENs, Герсбах сказал, что рекомендует им сосредоточиться на их текущих проектах с нуклеазами цинкового пальца. Однако “Он все равно пошел и поработал над TALEs и заставил ее работать очень быстро, и результаты были великолепными”, - сказал Герсбах.

Герсбах и его команда начали использовать TALEN в своих исследованиях по редактированию генома для лечения мышечной дистрофии Дюшенна. «Самым захватывающим в [TALEN] было то, что они привлекли в сферу редактирования генов так много людей», — сказал Герсбах.

Фотография графического абстрактного изображения (вверху), созданного с помощью BioRender, и флуоресцентного изображения (внизу), демонстрирующего функцию Т-клеток SMART CAR, разработанных компанией Cellectis. Слева, при отсутствии сигналов из микроокружения опухоли, специфичный для опухоли CAR не экспрессируется, и опухоль (зелёная) не уничтожается. При наличии специфичного сигнала TME (справа) экспрессируется второй CAR, и опухоль уничтожается.

Интерес к TALENs вышел за рамки академических исследований. Компания Recombinetics, занимающаяся биоинженерией и редактированием генов животных, с помощью новой технологии вывела первый бесплодный молочный скот. Затем компания Calyxt, занимающаяся биотехнологиями на основе растений, использовала TALENs для выведения первого коммерчески доступного растения с отредактированным геномом. «Это было началом революции в редактировании генома», — сказал Бох.

TALENs Расширяют CAR-Т-клеточную Терапию

В начале 2000-х годов компания Cellectis, разрабатывающая технологии редактирования генома, использовала мегануклеазы для избирательного изменения генома в клетках. Хотя эти инструменты иногда демонстрировали низкую эффективность при редактировании популяции клеток, повышенная точность и безопасность молекулярных инструментов в то время воодушевляли исследователей. «В то время мы праздновали победу», — сказал Жюльен Вальтон, инженер-биолог и вице-президент группы по генной терапии в Cellectis.

Когда TALENs появились на научной арене, они повысили эффективность редактирования генома. Первое поколение этих редакторов успешно редактировало до 25 процентов клеток. Более поздние версии обеспечивали эффективность 76 или почти 100 процентов для некоторых целевых изменений. «Можете ли вы представить себе революцию, которая произошла в то время?» — вспоминал Уолтон. «До эры TALEN мы были вполне довольны тем, что не имело терапевтического или биотехнологического значения. Когда был разработан TALEN, это стало похоже на реальность ”.

В 2011 году Университет Миннесоты выдал эксклюзивную лицензию на патент TALEN компании Cellectis. Одна из команд компании применила его в проектах по улучшению другой новой терапии рака — Т-клеток с химерным антигенным рецептором (CAR). При терапии CAR-T-клетками клетки пациента изолируются и генетически модифицируются для распознавания конкретного опухолевого антигена, а затем возвращаются пациенту в качестве лекарства от рака.

Эта терапия оказалась успешной у нескольких пациентов, однако исследователи признали, что, хотя использование собственных клеток пациента позволяет избежать риска атаки их иммунной системы на терапевтические клетки, это накладывает свои ограничения. У некоторых пациентов недостаточно Т-клеток для донорства. Наличие популяции Т-клеток от здорового донора, которую можно было бы использовать у нескольких пациентов, значительно расширило бы полезность CAR-Т-клеточной терапии, но для этого требовалось сделать Т-клетки невидимыми и не реагирующими на их нового хозяина.

Компания Cellectis решила эту проблему, используя TALENs для удаления гена Т-клеточного рецептора (TCR) из донорских Т-клеток и создавая универсальные CAR-T (UCART) клетки.  В 2015 году одна команда использовала TALENs для создания UCART-клеток, распознающих антиген на В-клетках, для лечения острого лимфобластного лейкоза у двух младенцев в рамках программы по оказанию помощи. Впоследствии, в 2020 и 2022 годах, эти клетки UCART продемонстрировали безопасность и эффективность в двух клинических испытаниях первой фазы.

TALENs как стартовая площадка для редактирования генома CRISPR

Всего через несколько лет после того, как TALENs появились в исследовательских лабораториях, система CRISPR Cas9 в бактериях была продемонстрирована как управляемая РНК эндонуклеаза и быстро стала использоваться в качестве инструмента для редактирования генов. По словам Герсбаха, несмотря на то, что это было огромным достижением само по себе, благодаря TALENs «редактированию генов стало уделяться гораздо больше внимания, и люди знали, что делать с CRISPR, когда он появился».

Что больше всего восхищало в [TALENs], так это то, что они привлекли в сферу редактирования генов так много людей.

Но у CRISPR было большое преимущество перед предыдущими редакторами генов. «CRISPR намного проще в применении. И это говорит специалист по TALEN», — сказал Богданов. Каждый RVD для пары оснований в целевой последовательности должен быть собран поэтапно, и исследователям нужно было сконструировать два TALEN, в то время как CRISPR Cas9 разрезает ДНК как единое целое.

«Большой размер и повторяющийся характер могут затруднить доставку [TALEN] в некоторых случаях», — сказал Герсбах. Но в некоторых случаях TALEN дают преимущество. Например, до недавнего времени системы CRISPR не могли эффективно локализоваться в митохондриях, поэтому TALEN в основном использовались для редактирования митохондриальной ДНК в моделях заболеваний, связанных с этой органеллой, в том числе с помощью редактирования оснований без CRISPR.

«В некоторых случаях, когда люди решали эти проблемы и добивались хорошей работы, технология может быть очень эффективной, и поэтому те, кто добился хорошей работы и вложил в неё средства, продолжают использовать её и сегодня», — сказал Герсбах.

Например, Валтон сказал, что TALENs обеспечивают наилучший баланс безопасности и точности для исследований его команды. Хотя белки могут быть громоздкими, что усложняет их производство и доставку, Валтон сказал, что повышенная нацеленность снижает вероятность того, что TALENs отрежут свою цель. Кроме того, в отличие от CRISPR, который требует, чтобы определенная последовательность находилась рядом с местом разреза, команда Cellectis может создать TALEN для любых конкретных локусов, которые они пожелают.

Недавно команда использовала эту особенность, чтобы применить свой дизайн клеток UCART для создания индуцируемой терапевтической клетки, которая активна только внутри опухоли. Используя TALENs, они заменили подавляющий ген последовательностью для опухолевого антигена CAR. “Это очень хороший пример создания CAR-Т-клеток, которые могут ощущать окружающую среду, нацеливаться на то, что должно быть нацелено, и щадить то, что можно сохранить”, - сказал Шипра Дас, иммуноонколог Cellectis, разрабатывающий CAR-Т-терапию с использованием технологии TALEN.

Далее команда исследователей изучает возможности применения генной терапии помимо CAR-T-клеток. «Мы только ощущаем первые толчки в этой области и с нетерпением ждём будущего, потому что оно будет супер-супер-супер захватывающим», — сказал Уолтон.

«В конечном счёте, TAL-эффекторы стали огромным шагом вперёд в разработке специфичных для ДНК связывающих белков, — сказал Богданов. — TAL-эффекторы произвели революцию в области таргетинга на ДНК, а CRISPR демократизировал её».

Автор: Шелби Брэдфорд, доктор философии, помощник редактора The Scientist. Она получила докторскую степень по иммунологии и микробиологии в Университете Западной Вирджинии и прошла стажировку в AAAS по работе со СМИ.