В. И. Глазко

Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А.Тимирязева, Москва, Россия

Морфо-функциональная организация генома, ее эволюция, вклад ее особенностей в регуляцию генной экспрессии до сих пор остается недостаточно изученными. Известное сочетание протяженных, консервативных сегментов и участков с высокой вариабельностью в микроном масштабе хромосом эукариот свидетельствует о внутренней подразделенности геномов. В то же время, до сих пор остается неизвестным, имеется ли какая-либо консервативность позиционирования относительно друг друга нуклеотидных последовательностей в нанометровом масштабе. Недавно выявленная фрактальная организация генетического материала предполагает наличие периодичности, «сегментированности» геномов на участки, фланкированные нуклеотидными последовательностями, обладающими определенным сходством (Lieberman-Aiden E., van Berkum N. L., Williams L. et al. Comprehensive Mapping of Long-Range Interactions Reveals Folding Principles of the Human Genome//Science. – 2009. – Vol. 326. – C. 289 – 293). Можно ожидать, что в формировании такой «сегментированности» (Глазко, 1997) в нанометровом масштабе могут принимать участие высокоповторенные участки ДНК, представляющие более 90% всего генома.

В этой связи, в целях выявления структурных особенностей в организации геномов, нами были выполнены сравнительные исследования полиморфизма ряда полилокусных спектров, полученных в полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием в качестве праймеров декануклеотидов, фрагментов микросателлитных локусов, терминальных участков ретротранспозонов, у ряда видов животных. Такие праймеры позволяют экспериментально выявлять геномное распределение инвертированных повторов, частота представленности которых в семействах высокоповторенных последовательностей ДНК, достигает 5%. Анализ распределения инвертированных повторов позволяет оценивать особенности взаимного позиционирования нуклеотидных последовательностей, способных к участию в формировании вторичных структур ДНК, необходимых, в частности, для опознавания регуляторных сигналов. Можно ожидать, что структурно-функциональные характеристики инвертированных повторов, их внутригеномное позиционирование будут оказывать существенное влияние и на их полиморфизм.

Для того, чтобы рассмотреть такие возможные связи, нами были выполнены сравнения полиморфизма ряда инвертированных повторов, диспергированных в геномах различных видов. Выполнен анализ распределения длин фрагментов ДНК, фланкированных декануклеотидами UBC-85 и UBC-126 (RAPD-PCR), ди- и тринуклеотидными микросателлитными локусами (ISSR-PCR) с различными коровыми мотивами. Рассматривался полиморфизм у 11 сельскохозяйственных и близкородственных диких видов млекопитающих, принадлежащих к отрядам парно- и неправнокопытных. Для амплификации фрагментов ДНК, использовали следующие праймеры с ди- м тринуклеотидными повторами: (GA)₉C, (AG)₉C, (AGC)₆T, (TGC)₆A, (AGC)₆G, (ACC)₆G, (GCT)₆A, (GAG)₆C, (TCG)₆G, (CTC)₆A, (CAC)₇A, (CTC)₆C, (GTG)₇C, (CAC)₇T.

В исследованиях полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными декануклеотидами (RAPD-PCR), на геномной ДНК разных видов млекопитающих были получены следующие данные. Полилокусные спектры RAPD-PCR зависят от нуклеотидной последовательности декануклеотида; распределение инвертированных декануклеотидных повторов имеет выраженные видоспецифичные черты; спектры продуктов амплификации, в основном, определяются 6-тью нуклеотидами на 3’ конце; отмечается широкая изменчивость динамики накопления продуктов амплификации с разных участков генома при одних и тех же условиях PCR.

Полученные данные свидетельствуют о наличии определенной неслучайности распределения сайтов узнавания декануклеотидов и специфичности спектра ампликонов в зависимости от используемого праймера и исследуемого вида.

На основании оценок распределения длин фрагментов ДНК, полученных в PCR при использовании 14-ти праймеров у разных видов млекопитающих, была определена доля ампликонов разной длины в спектрах продуктов амплификации. Обнаружено, что распределение ампликонов по длинам у доместицированных видов иное, чем у диких. В спектрах доместицированных видов относительно чаще (P<0,05) встречаются фрагменты ДНК сравнительно небольшого размера (1000 – 400 пар нуклеотидов, п.н.) чем у близкородственных диких видов. По ISSR-PCR маркерам распределение было следующим. У группы доместицированных видов фрагменты длиной в 2.0-2.5 тысяч пар оснований (т.п.о). – 12%, 1.1-1.9 т.п.о – 38%, длиной 0.4-1.0 т.п.о. – 50%; у диких – 17%, 44%, и 39% соответственно. Обнаружено также, что наиболее сложные спектры продуктов амплификации (по количеству ампликонов), дающие наиболее воспроизводимые и близкие значения оценок генетических взаимоотношений (по генетическим расстояниям, DN) между видами были получены при использовании в качестве праймеров, в основном, трех из 12-ти тринуклеотидных мотивов ДНК, принадлежащих к пурин/пиримидиновым трекам. Накопленные данные свидетельствуют о наличии неслучайности в распределении фрагментов ДНК, фланкированных инвертированным повтором участка микросателлитного локуса в зависимости от его нуклеотидной последовательности и принадлежности к пурин/пиримидиновым трекам. Обращает на себя внимание высокая точность воспроизводства спектров ампликонов, полученных таким образом: наблюдаются выраженные отличия между спектрами в случае использования в качестве праймера одного и того же корового микросателлитного мотива, но с разными «якорными» нуклеотидами, а также в случае мотива, сдвинутого на один нуклеотид или комплементарного ему. В ряде случаев обнаружено, что нуклеотидная длина фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитных локусов, отличается высоким консерватизмом и сохраняется между видами, принадлежащими к разным семействам. Из этого следует, что, не смотря на высокий уровень полиморфизма микросателлитных локусов, имеется определенное постоянство позиционирования их инвертированных повторов, которое сохраняется в геномах таксономически удаленных видов.

Выполненное сравнение спектров ампликонов с использованием в качестве праймеров фрагментов пурин/пиримидиновым треков микросателлитных локусов (AG)₉C и (GA)₉C свидетельствует, что в ряде случаев длина фрагментов ДНК, фланкированных ими, консервативна и сохраняется у разных видов. Такой консерватизм хорошо согласуется с представлениями А. Лима-де-Фария (Lima - de – Faria, 1987)о неслучайном распределении семейств тандемных повторов по длине хромосом и об участии некоторых из них в структурно-функциональной организации линейных хромосом эукариотов даже на таких небольших участках ДНК (2 т.п.н.), которые используют в популяционных исследованиях в качестве ISSR-маркеров геномного полиморфизма.

Выполненные сравнительные исследования полилокусных спектров фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитных локусов (ISSR-PCR), у ряда пород крупного рогатого скота позволили выявить локусы, консервативные у всех пород, вариабельные участки и сочетания фрагментов ДНК, присутствие которых имеет породоспецифичные особенности.

Полученные данные позволяют сделать следующие выводы.

Сравнительный анализ геномной ДНК крупного рогатого скота (серая украинская порода), зубров, бизонов с использованием RAPD-PCR маркеров (праймеры UBC-85, UBC–126), позволили обнаружить фрагменты ДНК, консервативные и дифференцирующие разные виды. В спектрах праймера UBC-85 выявлены шесть ампликонов, присутствовавшие в спектрах только у одного из рассмотренных видов (по 2 у каждого вида), удобные для разработки ДНК «штрихкодов» позиционирования инвертированных повторов этих декануклеотидов в геномах исследованных видов бычьих.

С использованием маркеров ISSR-PCR видоспецифичные фрагменты ДНК выявлены в спектрах праймера (AG)₉C у бизонов, в спектрах праймера (GA)₉C – у крупного рогатого скота.

Сравнительный анализ спектров фрагментов ДНК разной длины у пород крупного рогатого скота свидетельствует о наибольшей межпородной консервативности спектров ампликонов праймера (GA)₉C по сравнению со спектрами фрагментов ДНК, полученных при использовании в качестве праймера (AG)₉C. При сопоставлении спектров генофондов исследованных пород выделяются породоспецифичные сочетания фрагментов ДНК, которые могут рассматриваться как породный ДНК «штрихкод» позиционирования инвертированных повторов этих микросателлитных участков.

Отобранные фрагменты ДНК, сочетания которых дифференцируют виды бычьих и породы крупного рогатого скота, удобны для полилокусного генотипирования животных.

Нами также выполнен сравнительный анализ полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных терминальными участками ретротранспозон подобных элементов семейства R173 у ряда сортов риса и пшеницы. Выявлены отличия по распределению и полиморфизму таких участков, свидетельствующие об особенностях их взаимного позиционирования. Полученные данные свидетельствует о кластеризации ретротранспозон подобных элементов, причем такая кластеризация более стабильна у сортов риса по гомологичным элементам по сравнению с отличающимися в геномах пшениц. Результаты выполненного анализа свидетельствуют об отсутствии равновероятного распределения разных ретротранспозон подобных элементов, принадлежащих к семейству R173, по длине геномов. Полиморфные полилокусные спектры, удобные для решения ряда прикладных задач в генофондных исследованиях культурных растений, могут быть получены с использованием маркеров, основанных на оценке полиморфизма участков ДНК, связанных с кластерами разных ретротранспозон подобных элементов. Наблюдаемая кластеризация ретротранспозон подобных элементов также согласуется с наблюдениями Лима де Фария о неслучайности чередования гетерохроматиновых блоков по длине хромосом у ряда видов растений, позволившая ему сформулировать гипотезу о «хромосомных полях», благодаря которым нуклеотидные последовательности и скопление различных семейств повторов, включая центромерные и теломерные, непосредственно связаны с морфологией хромосом, «хромосомным фенотипом».

В последние годы накоплено много данных, подтверждающих эту гипотезу о тесной связи между молекулярной структурой материала наследственности и морфологией хромосом. К таким данным можно отнести факты неслучайного распределения ретротранспозонов по длине хромосом Arabidopsis, а также ряда видов грибов; неслучайная локализация семейств ретротранспозонов в центромерных районах некоторых видов растений, в частности, кукурузы, локализация ретротранспозонов в теломерных районах хромосом. С представлением о взаимной детерминированности микро- и наноуровней организации генетического материала хорошо согласуются данные об участии механизмов ретровирусной экспансии в возникновении самой линейной хромосомы эукариот, ее теломерных и центромерных структур. В связи с этим очевидно, что оценка геномных полиморфизмов должна выполняться с учетом принадлежности молекулярно-генетических маркеров к семействам различных геномных элементов, имеющих неслучайное распределение по длине хромосом, структурно-функциональную организацию, а также закономерности консервативности/полиморфизма и эволюции.