Т. П. Рябых¹, Т. В. Осипова¹, З. А. Соколова¹, Н. Б. Паклин², В. И. Грабко³, В. Н. Морозов⁴, А. Ю. Барышников¹

¹ Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва, Россия;

²Московский государственный университет экономики, статистики и информатики (Рязанский филиал), Рязань, Россия;

³Институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва, Россия;

⁴Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино-на-Оке, Россия

Технологии нано- и микрочипов позволяют проводить одновременное определение сразу нескольких (в перспективе – сотен и тысяч) биомаркеров в сыворотке крови больного и могут стать прорывными технологиями, позволяющими существенно улучшить диагностику злокачественных новообразований.

Целью проекта является создание и применение многопараметрических диагностических систем – на основе технологий микро- и наночипов для выявления онкологических заболеваний. Проект опирается на три технологии изготовления биочипов.

1. Технология биочипов на основе трехмерных гидрогелей. Разработана в ИМБ им. В.А.Энгельгардта РАН под руководством акад. А.Д. Мирзабекова (А.Д. Мирзабеков и др., 2001). Биочип представляет собой подложку (пластик, стекло и др.), на которую нанесена матрица полусферических гелевых элементов с контролируемым размером пор (20-100 нм). Каждый гелевый элемент с иммобилизованным индивидуальным зондом (например, белком) имеет объем 0.1 нл, и в нем проходит иммунологическая реакция: «сэндвич»-вариант иммуноанализа с флуоресцентной детекцией. Флуоресцентные сигналы от гелевых элементов регистрируют с помощью специального анализатора. На основе этой технологии разработаны диагностические системы: (1) для одновременного определения двух форм ПСА (простата-специфического антигена), - общей и свободной и (2) для одновременного определения шести опухолевых маркеров: ПСАобщ, ПСАсв (свободная форма ПСА), АФП (альфа-фетопротеина), РЭА (раковоэмбрионального антигена), ХГЧ (хорионического гонадотропина человека) и НСЕ (нейрон-специфической енолазы). Аналитические характеристики новых систем сопоставлены с характеристиками стандартных иммуноферментных систем фирмы CanAg (Швеция), каждая из которых может определять только один маркер. Показано, что имеется высокая степень корреляции данных, полученных в двух видах систем.

2. Технология наночипов. Разработана В.Н.Морозовым (Morozov et al., 2007). Позволяет проводить так называемый. «активный» иммуноанализ, проходящий в проточной камере, нижняя и верхняя стенки которой представляют собой диализные мембраны. На поверхность нижней мембраны с помощью установки для электронапыления наносят микроматрицу моноклональных антител, толщиной в одну или несколько молекул белка. То есть, происходит формирование нанопокрытия толщиной в 20-50 нм, контролируемого по плотности, толщине и ориентации молекул. Взаимодействие с антигеном происходит в электрическом поле, а взаимодействие со вторыми антителами, связанными с магнитными частицами, усиливается магнитным полем. Наночип позволяет определять биомаркеры с очень высокой чувствительностью (500-1000 молекул аналита) за несколько минут. Регистрацию сигналов от наночипов проводят с использованием обычного темнопольного микроскопа.

3. Технология микрочипов на основе микросфер (x-MAP). Технология разработана в России, но развитие получила в США. Для иммобилизации моноклональных антител используют коммерчески доступные карбоксилированные микросферы, заполненные внутри смесью красных и инфракрасных красителей. Система может определять до 100 биомаркеров. Моноклональные антитела, иммобилизованные на карбоксилированных микросферах, взаимодействуют с антигеном. Затем к реакционной смеси добавляют биотинилированные вторые антитела, также специфически взаимодействующие с антигеном, после чего добавляют конъюгат стрептавидина с фикоэритрином и регистрируют флуоресцентные сигналы от фикоэритрина и флуорохромов, находящихся внутри микросфер, на специальном анализаторе. Таким образом, в результате иммунологической реакции на микросфере формируется тримолекулярный слой, - нанопокрытие толщиной 20-30 нм, контролируемое по плотности, толщине и ориентации молекул.

Результаты исследований

1. Микрочипы на основе гидрогелей. Исследована группа больных раком кишечника (15 человек). В каждом образце сыворотки крови с помощью двух типов диагностических систем (тест-система в формате микрочипа и стандартные иммуноферментные тест-системы) измерены уровни следующих маркеров: ПСА_{общ, ,} ПСА_св, АФП, РЭА, НСЕ и ХГЧ. В наибольшем числе образцов, исследованных с помощью микрочипов, наблюдался повышенный уровень РЭА, главного маркера рака кишечника; второе место занимал НСЕ. В отдельных образцах наблюдалось повышение уровней и других маркеров: ХГЧ, АФП, ПСАобщ и ПСАсв. В одном образце наблюдалось превышение уровней всех шести опухолевых маркеров. Похожая картина была получена для тех же образцов сыворотки крови при помощи стандартных иммуноферментных наборов CanAg.

В группе больных доброкачественными заболеваниями кишечника, циррозом печени и хроническим панкреатитом (14 человек) при измерении в тест-системе на основе микрочипа лишь у трех больных из 14 наблюдалось незначительное повышение уровней опухолевых маркеров. В традиционных иммуноферментных системах CanAg ни у одного из больных не наблюдалось повышения какого-либо маркера. Исследование группы больных раком предстательной железы (РПЖ) показали, что уровень маркеров ХГЧ и АФП во всех 13 образцах не превышал верхнюю границу нормы. Для всех остальных маркеров наблюдалось превышение, в наибольшем числе образцов, – для ПСА, главного маркера РПЖ, но также и для НСЕ и РЭА. Аналогичные данные были получены в системах CanAg.

Таким образом, как при раке кишечника, так и при РПЖ увеличивается экспрессия не одного, а нескольких маркеров.

Для сравнения диагностической эффективности систем, основанных на определении одного маркера, и многопараметрических систем был проведен ROC-анализ и оценены площади под ROC-кривыми (AUC). При оценке диагностической эффективности многопараметрических систем, каковыми являются микрочипы, была применена множественная логистическая регрессия. Показано, что площади под ROC-кривыми для моделей, использующих шесть маркеров, были выше, чем для моделей, использующих единичные маркеры.

Таким образом, использование многопараметрических систем позволяет улучшить диагностику рака кишечника и РПЖ по сравнению с использованием каждого из маркеров по отдельности.

2. Микрочипы на основе микросфер. Образцы сыворотки крови больных раком кишечника (14 чел.) были протестированы в диагностической системе на основе технологии x-MAP (Novagen, США), предназначенной для определения другого набора опухолевых маркеров: РЭА, АФП, СА 125, СА 19-9, СА 15-3 и пролактин. Как и в случае гелевых чипов, наибольшее число образцов сывороток имело повышенный уровень РЭА, но наблюдалось также повышение и других маркеров: СА 19-9 (3 случая), СА 15-3 (2 случая) и СА 125 (1 случай). Не было выявлено превышения уровней АФП и пролактина. В контрольной группе, состоящей из шести больных доброкачественными заболеваниями кишечника, ни один маркер не был повышен.

3. Наночипы. Начаты работы по созданию диагностической системы в формате наночипа для анализа опухолевых маркеров, и показана возможность проведения в ней сэндвич-иммуноанализа на ПСА.

Таким образом, предварительные результаты, полученные с помощью микрочипов на основе трехмерных гидрогелей и технологии x-MAP, показывают, что в образцах сыворотки крови больных РПЖ и раком кишечника может повышаться уровень не одного, а нескольких (в отдельных случаях, - шести) опухолевых маркеров и одновременное определение нескольких маркеров с помощью микрочипов может увеличить эффективность диагностики рака кишечника и РПЖ.