Гусев Ю. С. ^1,2, Волохина И. В. ², Чумаков М. И. ^1,2*

¹-Саратовский государственный университет им. Н.Г.Чернышевского,
410025, Саратов, ул. Астраханская, 83, * - e-mail: chumakov@ibppm.sgu.ru

²-Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, 410049, Саратов,просп. Энтузиастов, 13

Почвенные бактерии рода Agrobacterium способны переносить генетическую информацию в составе Т-ДНК в эукариотическую клетку. Экспрессия перенесенных генов в составе Т-ДНК в клетке-хозяине изменяет ее свойства, что уже нашло широкое применение в сельскохозяйственной биотехнологии зарубежных стран при создании трансгенных растений. Сравнительно недавно представлены доказательства переноса агробактериальной Т-ДНК в геном животных клеток [1]. Последний факт открывает новые возможности использования Т-ДНК как возможного вектора для переноса функциональных генов в биомедицинских целях (генная терапия). Белок вирулентности VirE2 способен неспецифически и кооперативно связываться с одноцепочечной ДНК (Т-ДНК, transfer ssDNA) и образовывать Т-комплекс в цитоплазме хозяйской растительной клетки [2,3]. Комплекс Т-ДНК-VirD2 и белок VirE2 переносятся независимо, в то время как экспорт белка VirE2 зависит от наличия белка VirE1 в бактериальной клетке [4,5]. Перенос Т-ДНК в эукариотическую клетку относится к IV типу секреции, согласно которому перенос ДНК осуществляется по механизму, сходному с бактериальной конъюгацией [6]. Конъюгация предполагает контакт мембран партнеров, формирование белковой поры, через которую осуществляется перенос однонитчатой ДНК. Показано, что белок VirE2 возможно участвует в формировании белковой поры в искусственной плоской липидной мембране, через которую могут переноситься короткие олигонуклеотиды и, возможно, Т-ДНК [7]. Однако, в настоящее время неясно, как происходит в природе перенос Т-ДНК через VirЕ2-зависимую пору, неизвестна структура поры.

Целью работы являлось компьютерное исследование комплексов образуемых из белка VirE2 и комплексов VirE2 с однонитчатой ДНК. С целью установления возможного сходства механизмов попадания ДНК в эукариотическую клетку проведен поиск гомологии транспортных белков бакуловирусов и белка VirE2 с помощью программы Blast.Установлено, что белки семейства бакуловирусов и белок VirE2 сходства не имеют. Используя биоинформационные методы, спомощью программы Mole-Online, в комплексе из белков VirE2 и VirE1 обнаружено 3 канала с диаметрами 0.2, 0.3 и 0.8 нм соответственно, что недостаточно для прохождения однонитчатой ДНК, поскольку ее диаметр составляет 1.2 нм. Было обнаружено, что в поре, построенной в С-концевом домене белка VirE2 по типу TIM-бочки, имеется канал диаметром 1.3 нм, что недостаточно для прохождения комплекса Т-ДНК-VirD2, т.к. белок VirD2 имеет размеры 2х4 нм, согласно нашей оценке 3D модели VirD2 с помощью Swiss-PdbViewer. С использованием программы GRAMM-X смоделированы комплексы из двух, трех, четырех, шести белков VirE2, которые с помощью программы Charmm-Gui интегрированы в мембрану [8]. В комплексе из двух белков VirE2 в мембране обнаружен канал диаметром 2.2 нм между аминокислотными остатками Ile330 VirE2(№1) и Ile330 VirE2(№2). Однако канал сужен до 0.6 нм за счет междоменной петли (между Ala341 обоих белков). В комплексе из четырех белков VirE2 в мембране обнаружен канал диаметром 3.7 нм. Проведено компьютерное моделирование возможного прохождения Т-ДНК в комплексе с белком VirD2 через липидную мембрану со встроенным поровым комплексом из четырех белков VirE2. Таким образом, с помощью компьютерного моделирования впервые предсказана возможность формирования пор в комплексах из двух и четырех белков VirE2 с диаметром канала 2.2 и 3.7 нм, соответственно, что достаточно для прохождения ДНК.

Списоклитературы:

1. Kunik T., Tzfira T., Kapulnik Y., Gafni Y., Dingwall C., Citovsky V. Genetic transformation of HeLa cells by Agrobacterium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (98) (2001) 1871-1876.

2. Gelvin S.B., Agrobacterium VirE2 protein can form a complex with T strand in the plant cytoplasm //J. Bacteriol. 181 (1998) 4300-4302.

3. Grange W., Duckely M., Husale S., Jacob S., Engel A., Hegner M., VirE2: a unique ssDNA-compacting molecular machine// PLoS Biology 6 (2008) 0343-0351.

4. Sundberg C., Meek L., Carroll K., Das A., Ream W., VirE1 protein mediated export of the single-stranded DNA binding protein VirE2 from A. tumefaciens into plant cells// J. Bacteriol. 78 (1996) 1207-1212.

5. Mysori R.S., Bassuner D., Deng X.B., Darfinian N.S., Motchoulski A., Ream W., Role of Agrobacterium tumefaciens VirD2 protein in T-DNA transfer and integration// Mol.Plant Microb. Interact. 11 (1998) 662-683.

6. Chandran V., Fronzes R., Duquerroy S., Cronin N., Navaza J., Waksman G., Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system// Nature 462 (2009) 1011-1016.

7. Dumas, F., Duckely, M., Pelczar, P., Van Gelder, P. & Hohn, B. An Agrobacterium VirE2 channel for transferred-DNA transport into plant cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (2001) 485-490.

8. Чумаков М.И., Мазилов С.И., Гусев Ю.С., Волохина И.В. Исследование способности агробактериального белка VirE2 к образованию пор в мембранах // Биомембраны 2010. №5. С.00-00